De grootste verschil tussen GFP en EGFP is dat de GFP (staat voor Green Fluorescent Protein) is een eiwit dat heldergroene fluorescentie vertoont bij blootstelling aan blauw licht, terwijl EGFP (staat voor Enhanced Green Fluorescent Protein) sterkere fluorescentie vertoont dan GFP. Verder is een ander belangrijk verschil tussen GFP en EGFP dat het GFP een wildtype eiwit is dat is geïsoleerd uit de kwal, Aequorea victoria. Maar EGFP is een gemanipuleerde variant van het oorspronkelijke wildtype.

GFP en EGFP zijn twee soorten eiwitten die als interne chromoforen dienen. Ze hebben geen bijkomende enzymen/substraten, cofactor of genproducten nodig om hun kleur te vertonen. Daarom worden beide gebruikt als een reporter van genexpressie in de moleculaire biologie.

Chromofoor, EGFP, GFP, groene fluorescentie, wildtype proteïne

Wat is GFP

GFP (groen fluorescerend eiwit) is een eiwit dat groen oplicht onder blauw of UV-licht. Het komt van nature voor in de kwal, Aequorea Victoria. GFP bestaat uit 238 aminozuren. De grootte van GFP is 26,9 kDa. GFP is een krachtig hulpmiddel in de moleculaire biologie vanwege de intrinsieke fluorescentie zonder enig bijkomend molecuul. De fluorescentie is vanwege de covalente herschikking van aangrenzende aminozuren van het eiwit. Na de vouwing van het eiwit vormen de hoofdketenatomen, Ser65, Tyr66 en Gly67 de sterk geconjugeerde, vlakke p-hydroxybenzylideneimidazolinonchromofoor in aanwezigheid van O₂. De kristalstructuurstudies onthullen dat de pakking van de chromofoor in de kern van de β-barrelstructuur van het molecuul het beschermt tegen uitdoving door paramagnetische zuurstof, waterdipolen of cis-trans-isomerisatie. Bovendien verbeteren de niet-covalente interacties van de chromofoor met de naburige moleculen de spectrale eigenschappen ervan.

Figuur 1: Lintweergave van GFP en fluorofoor

GFP kan tijdens de transgene modificaties in een organisme worden geïntroduceerd. Het kan ook generaties lang worden onderhouden. Het belangrijkste nadeel van het wildtype GFP is de verminderde effectiviteit van het eiwit in celbeeldvorming veroorzaakt door de lage efficiëntievouwing bij fysiologische temperaturen zoals 37 ° C, waardoor het fluorescerende signaal valt. Ook is de rijpingssnelheid van GFP in de gastheercel traag, terwijl deze de neiging heeft te aggregeren. Er kunnen twee excitatiepieken worden waargenomen vanwege de aanwezigheid van twee verschillende vormen van de chromofoor. Eiwitengineering heeft echter de meeste problemen opgelost door variante vormen van het wildtype GFP te introduceren.

Wat is EGFP

EGFP (enhanced green fluorescence protein) is een variant van het wildtype GFP met emissie met hogere intensiteit ten opzichte van GFP. Het is een van de eerste en belangrijkste GFP-varianten. De twee mutaties, F64L en S65T, genereren EGFP met een grotere vouwefficiëntie bij 37 °C. Interessant is dat EGFP een enkele excitatiepiek heeft bij ~ 490 nm vanwege het onderdrukken van de 395 nm-piek door S65T, omdat het de geïoniseerde toestand van Glu222 in de buurt moduleert. Aan de andere kant verhoogt de F64L de vouwefficiëntie bij 37 °C. Belangrijk is dat de codonsequentie van EGFP is geoptimaliseerd voor de expressie in de zoogdiercellen.

Figuur 2: EGFP-expressie

Overeenkomsten tussen GFP en EGFP

Verschil tussen GFP en EGFP

Definitie

GFP: Een wildtype eiwit dat groene fluorescentie vertoont onder blauw of UV-licht en dat van nature voorkomt in de kwal, Aequorea Victoria

EGFP: Een variant van het wildtype GFP met emissie met hogere intensiteit met betrekking tot GFP

Betekent

GFP: Groene Fluorescentie-eiwit

EGFP: Verbeterd groen fluorescentie-eiwit

Oorsprong

GFP: Wildtype

EGFP: Mutant

64^e Aminozuur

GFP: fenylalanine

EGFP: Leucine

65^e Aminozuur

GFP: serine

EGFP: Threonine

Helderheid van de kleur

GFP: Fel groen

EGFP: Helderder groen

Excitatiepieken

GFP: Twee pieken (395 nm en 490 nm)

EGFP: Enkele piek (490 nm)

Vouwefficiëntie bij 37 °C

GFP: Laag

EGFP: Hoog

Conclusie

GFP is het wildtype eiwit dat heldergroene fluorescentie vertoont bij blootstelling aan blauw of UV-licht. EGFP is een variant van GFP die fluorescentie met een hogere intensiteit vertoont in vergelijking met GFP. Het belangrijkste verschil tussen GFP en EGFP is dus de intensiteit van de groene fluorescentie die elk eiwit uitstraalt.

Verwijzing:

1. Arpino, James A.J., et al. "Kristalstructuur van verbeterd groen fluorescerend eiwit tot 1,35 Å resolutie onthult alternatieve conformaties voor Glu222." PLOS Medicine, Public Library of Science, journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0047132.

Afbeelding met dank aan:

1. "Gfp en fluorofoor" door Raymond Keller (Raymond Keller (talk)), onder auspiciën van Crystal Protein. - Eigen werk (Public Domain) via Commons Wikimedia 2. "Fgams ppat egfp puncta" door Zhao A, Tsechansky M, Swaminathan J, Cook L, Ellington AD, et al. (2013) Transiënt getransfecteerde purine biosynthetische enzymen vormen stresslichamen. PLoS ONE 8(2): e56203. doi: 10.1371/journal.pone.0056203 (CC BY 3.0) via Commons Wikimedia