Belangrijkste verschil - PCR versus RT-PCR

PCR en RT-PCR zijn twee belangrijke technieken in de moleculaire biologie. PCR is in de jaren tachtig ontwikkeld door Kary Mullis. Het is in staat om het aantal kopieën van een bepaald gen op een exponentiële manier te vergroten, waardoor de detectie van dat specifieke DNA-fragment wordt vergemakkelijkt. Taq-polymerase is het enzym dat het meest wordt gebruikt in PCR-systemen. Het is een thermostabiel enzym. Bij RT-PCR wordt reverse transcriptie gevolgd door PCR. Het enzym reverse transcriptase is betrokken bij de synthese van complementair DNA uit RNA. De grootste verschil tussen PCR en RT-PCR is dat: PCR gebruikt dubbelstrengs DNA als sjabloon, terwijl RT-PCR RNA als sjabloon gebruikt.

Belangrijkste gebieden die worden gedekt

1. Wat is PCR - Definitie, proces, toepassing 2. Wat is RT-PCR - Definitie, kenmerken, toepassing 3. Wat is het verschil tussen PCR en RT PCR – Vergelijking van de belangrijkste verschillen

Sleutelbegrippen: PCR, RT-PCR, polymerasekettingreactie, omgekeerde transcriptie-polymerasekettingreactie, DNA-sjabloon, DNA-polymerase, denaturatie, gloeien, primerverlenging

Wat is PCR

PCR (Polymerasekettingreactie) is een relatief eenvoudige maar revolutionaire methode. PCR gebruikt het vermogen van het enzym DNA-polymerase om nieuwe DNA-strengen te synthetiseren op een complementaire manier aan de aangeboden template-streng. PCR is een onmisbare techniek die wordt gebruikt in zowel klinische als onderzoekslaboratoria voor functionele analyse van genen, diagnose en monitoring van erfelijke ziekten, DNA-klonering, sequencing en oude DNA-amplificatie. DNA-template, nucleotiden, primers en DNA-polymerase zijn de vier belangrijkste componenten van PCR. De DNA-sjabloon is gewoonlijk een dubbelstrengs DNA met de doelsequentie die moet worden geamplificeerd. Taq DNA-polymerase die is geïsoleerd uit Thermus aquatics wordt vaak gebruikt in PCR. De Pfu-DNA-polymerase is een ander type DNA-polymerase met hoge betrouwbaarheid. Zowel Taq- als Pfu-polymerasen zijn hittebestendig. De nucleotiden die door de DNA-polymerasen worden toegevoegd, zijn adenine (A), guanine (G), cytosine (C) en thymine (T). Omdat DNA-polymerase alleen een nieuw nucleotide kan toevoegen aan een 3'-uiteinde van een reeds bestaande DNA-streng, is een oligonucleotide-primer vereist voor de initiatie van DNA-synthese. De vereiste van een primer in PCR maakt het mogelijk om alleen een specifiek gebied in de sjabloon af te bakenen. De doelsequentie wordt geflankeerd door voorwaartse en achterwaartse primers. Aan het einde van een PCR worden nieuwe kopieën, amplicons genaamd, van een specifieke DNA-sequentie verzameld in miljarden. De componenten van de PCR moeten op een zodanige manier worden geoptimaliseerd dat de PCR-prestaties worden verbeterd en storingen worden geminimaliseerd.

PCR is een geautomatiseerd proces dat wordt uitgevoerd door thermische cyclers, die kunnen schakelen tussen verschillende temperaturen. PCR is een proces in drie stappen.

1. Denaturatie – De dubbelstrengs DNA-template wordt door verhitting tot 94-95 °C in twee enkele strengen gescheiden.
2. gloeien – De forward en reverse primers binden aan de complementaire sequenties in de template. De temperatuur van deze stap is afhankelijk van de smelttemperatuur van de primercombinatie.
3. Primer extensie - DNA-polymerase-enzym verlengt elk van de primers aan hun 3'-uiteinde door complementaire basen aan de groeiende streng toe te voegen. De optimale temperatuur van Taq-polymerase, 72 °C, wordt gebruikt als de temperatuur in de verlengingsstap. De duur van de verlenging hangt af van het aantal basenparen in de matrijsstreng.

De drie stappen worden 28-35 keer herhaald.

Figuur 1: Polymerasekettingreactie

De producten van de PCR worden op grootte gefractioneerd door middel van agarosegelelektroforese in vergelijking met een DNA-ladder. De visualisatie van DNA op een agarosegel wordt gedaan door te kleuren met ethidiumbromide en te observeren onder UV. De geamplificeerde DNA-banden onder UV in een met ethidiumbromide gekleurde gel worden getoond in figuur 2. De DNA-ladder wordt getoond in het meest linkse putje.

Figuur 2: DNA-banden

Wat is RT-PCR

RT-PCR (Omgekeerde transcriptie-polymerase kettingreactie) is een van de meest gevoelige technieken die worden gebruikt voor de detectie van mRNA. RNA is het geschikte sjabloon voor het verzamelen van informatie over de genexpressie van een normaal weefsel of de genexpressie van een geïnfecteerd weefsel. De template voor de RT-PCR kan respectievelijk totaal RNA of viraal of bacterieel RNA zijn. RNA wordt omgekeerd getranscribeerd in complementair DNA (cDNA) door het enzym reverse transcriptase. De optimale temperatuur van reverse transcriptase is 46 °C. Het cDNA wordt gebruikt in PCR om het product te verkrijgen. Stappen in de reverse transcriptie PCR worden getoond in figuur 3.

Figuur 3: RT-PCR

RT-PCR kan worden uitgevoerd in een tweestaps- of eenstapsreactie. In de tweestapsreactie worden de omgekeerde transcriptie en PCR in twee afzonderlijke stappen uitgevoerd. In eenstaps RT-PCR wordt reverse transcriptie gevolgd door PCR in een enkele buis op een sequentiële manier. Zowel cDNA als het uiteindelijke PCR-product kunnen op een agarosegel worden gelopen voor de fractionering op grootte en visualisatiedoeleinden. Eenstaps- en tweestaps-RT-PCR worden getoond in figuur 4.

Afbeelding 4: Eenstaps- en tweestaps RT-PCR

Verschil tussen PCR en RT-PCR

Definitie

PCR: PCR is een techniek die in de moleculaire biologie wordt gebruikt om een ​​DNA-segment te amplificeren en miljoenen kopieën van een DNA-sequentie te genereren.

RT-PCR: RT-PCR is een variant van PCR die wordt gebruikt bij de detectie van genexpressie in de moleculaire biologie.

Stappen

PCR: Denaturatie, annealing en extensie zijn de drie stappen in PCR.

RT-PCR: Bij RT-PCR wordt reverse transcriptie gevolgd door PCR.

Sjabloon

PCR: Een dubbelstrengs DNA-molecuul dient als sjabloon voor PCR.

RT-PCR: Een enkelstrengs RNA-molecuul dient als sjabloon voor de reverse transcriptie. Een enkelstrengs DNA-molecuul dient als sjabloon voor de PCR.

Gebruikte enzymen

PCR: DNA-polymerase wordt gebruikt als het enzym in PCR.

RT-PCR: Reverse transcriptase en DNA-polymerase worden gebruikt als enzymen in RT-PCR.

Inleidingen

PCR: Voorwaartse en achterwaartse primers worden gebruikt in de PCR.

RT-PCR: Alleen de reverse primer wordt gebruikt voor de reverse transcriptie en zowel forward als reverse primers worden gebruikt in de PCR.

Gevoeligheid

PCR: PCR is een gevoelige methode.

RT-PCR: RT-PCR is gevoeliger dan PCR.

Toepassingen

PCR: PCR wordt gebruikt bij functionele analyse van genen, diagnose en monitoring van erfelijke ziekten, DNA-klonering, DNA-sequencing en oude DNA-amplificatie.

RT-PCR: RT-PCR wordt gebruikt bij de detectie van genexpressie.

Conclusie

PCR en RT-PCR zijn twee belangrijke technieken die in de moleculaire biologie worden gebruikt. Zowel PCR als RT-PCR zijn geautomatiseerde technieken die in staat zijn om het aantal kopieën van een doel-DNA-sequentie, die wordt gedefinieerd door de voorwaartse en achterwaartse primers, exponentieel te verhogen. Bij PCR wordt dubbelstrengs DNA als matrijs gebruikt. Door PCR kunnen DNA-klonering, DNA-sequencing en functionele analyse van de genen worden gedaan. Bij RT-PCR kan genexpressie in een bepaald weefsel worden waargenomen door RNA te amplificeren. Het belangrijkste verschil tussen PCR en RT-PCR zit in hun sjablonen die in elke reactie worden gebruikt en hun toepassingen.

Verwijzing:

1. "Polymerasekettingreactie (PCR)." Nationaal centrum voor informatie over biotechnologie. Amerikaanse National Library of Medicine, n.d. Web. Beschikbaar Hier. 01 juni 2017. 2. "Polymerasekettingreactie (of PCR)." Klonen en moleculaire analyse van genen. n.p., n.d. Web. Beschikbaar Hier. 01 juni 2017. 3. Biolabs, New England. "CDNA-synthese en RT-PCR." CDNA-synthese & RT-PCR | NEB. n.p., n.d. Web. Beschikbaar Hier. 01 juni 2017.

Afbeelding met dank aan:

1. "Polymerasekettingreactie" door Enzoklop - Eigen werk (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia 2. "DNA fragmendid etiidiumbromiidiga värvitud agaroosgeelis." Door Rainis Venta - Eigen werk (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia 3. "Reverse transcriptie polymerasekettingreactie" Door Jpark623 - Eigen werk (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia 4. "Eenstaps versus tweestaps RT-PCR "door Jpark623 - Eigen werk (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia