De grootste verschil tussen genomisch DNA en plasmide-DNA-isolatie is dat: genomische DNA-isolatie maakt gebruik van sterke lysis, inclusief de enzymatische of mechanische afbraak van de celmembranen om het genomische DNA in de oplossing vrij te geven, terwijl plasmide-DNA-isolatie milde alkalische lysis gebruikt om plasmide-DNA samen met het genomische DNA in de oplossing te krijgen. Verder kan bij de isolatie van genomisch DNA, volgend op de cellysis, genomisch DNA worden gezuiverd van lipidemembraan en eiwitten, terwijl bij isolatie van plasmide-DNA neutralisatie met kaliumacetaat het plasmide-DNA van genomisch DNA zal scheiden.

Genomisch DNA en plasmide-DNA-isolatie zijn twee extractiemethoden die belangrijk zijn voor DNA-isolatie om te gebruiken in verschillende technieken in de biotechnologie.

Cellysis, genomische DNA-isolatie, plasmide-DNA-isolatie

Wat is genomische DNA-isolatie?

Genomische DNA-isolatie is de extractieprocedure van genomisch DNA uit cellen. Een van de belangrijkste kenmerken van genomische DNA-isolatie is dat het een sterke lysisstap vereist om genomisch DNA in de oplossing vrij te geven. Over het algemeen kan de celwand enzymatisch worden afgebroken door lysozymen en proteïnase K. Daarentegen is mechanische afbraak van de celwand het meer universele proces dat wordt uitgevoerd door kralen op een vortex te slaan. Na cellysis is DNA-zuivering, hetzij door fenol-chloroform-extractie of andere methoden, essentieel voor het reinigen van lipide dubbellaag, eiwitten en ander celafval.

Figuur 1: Genomische DNA-isolatie

Bovendien is degradatie van genomisch DNA een van de belangrijkste nadelen die optreden tijdens genomische DNA-isolatie. Daarom is het essentieel om lage temperaturen te houden of chemische remmers te gebruiken om DNase-activiteit te voorkomen en tegelijkertijd chromosoombreuk tijdens extractie te voorkomen.

Wat is plasmide-DNA-isolatie?

Plasmide-DNA-isolatie is het extractieproces van plasmide-DNA uit cellen. Het houdt ook plasmide-DNA uit het genomische DNA van deze cellen. Een van de belangrijkste punten van plasmide-DNA-isolatie is het uitvoeren van een milde cellysisprocedure zoals alkalische lysis. Kortom, de buffer van alkalische lysis bevat natriumhydroxide en SDS, die zowel plasmide-DNA als genomisch DNA volledig denatureren. Het is echter essentieel om overmatige denaturatie te voorkomen, die het plasmide-DNA onomkeerbaar kan denatureren.

Figuur 2: Plasmide-DNA-isolatie

De stap die volgt op cellyse is de neutralisatie in plasmide-DNA-isolatie. In het algemeen is kaliumacetaat het reagens voor neutralisatie. Vanwege de kleine omvang van plasmide-DNA in vergelijking met genomisch DNA, ondergaat plasmide-DNA gemakkelijk renaturatie, terwijl genomisch DNA de neiging heeft in de war te raken. Daarna kan centrifugeren een pellet vormen met genomisch DNA gebonden aan eiwitten. Daarom blijft plasmide-DNA in het supernatant. Uiteindelijk kan dit plasmide-DNA worden geprecipiteerd met ethanol.

Overeenkomsten tussen genomisch DNA en plasmide-DNA-isolatie

Verschil tussen genomisch DNA en plasmide-DNA-isolatie

Definitie

Genomische DNA-isolatie verwijst naar de techniek die wordt gebruikt om DNA in biologische monsters te isoleren, terwijl plasmide-DNA-isolatie verwijst naar de isolatie van plasmide-DNA uit biologische monsters.

Monsters

Genomisch DNA kan worden geïsoleerd uit verschillende biologische monsters, terwijl plasmide-DNA-isolatie voornamelijk afkomstig is van celculturen van bacteriën of schimmels.

cellysis

Denaturatie

Verder is de pH van de cellysebuffer voor genomische DNA-isolatie 7-9, wat DNA niet denatureert, terwijl de pH van de cellysebuffer van plasmide-DNA-isolatie 12.1-12.3 is, wat zowel plasmide-DNA als genomisch DNA denatureert.

Tweede stap

Bovendien kan na de cellysis genomisch DNA worden gezuiverd van lipidemembraan en eiwitten, terwijl in plasmide-DNA-isolatie de tweede stap is om te neutraliseren met kaliumacetaat om plasmide-DNA van genomisch DNA te scheiden.

Tijdens centrifugeren

Tijdens centrifugatie verschijnt genomisch DNA in de pellet, terwijl plasmide-DNA in het supernatant verschijnt.

Betekenis

Genomische DNA-isolatie is ook een vrij eenvoudige methode, terwijl plasmide-DNA-isolatie een meer gevoelige methode is.

Downstream-toepassingen

De stroomafwaartse toepassingen van genomische DNA-isolatie kunnen PCR of sequencing zijn, terwijl de stroomafwaartse toepassingen van plasmide-DNA-isolatie klonering van transfectie of gentherapie kunnen zijn.

Conclusie

Genomische DNA-isolatie is een methode om DNA uit verschillende soorten biologische monsters te extraheren. Over het algemeen is het een meer rechttoe rechtaan methode, die de harde afbraak van celmembranen omvat, gevolgd door genomische DNA-zuivering van lipide dubbellaag, eiwitten en ander celafval. Aan de andere kant is plasmide-DNA-isolatie een meer gevoelige methode, die milde alkalische lysis gebruikt om celmembranen open te breken. Bovendien bevat het een neutralisatiestap om plasmide-DNA te scheiden van genomisch DNA. Ten slotte komt plasmide-DNA voor in het supernatant. Daarom is het belangrijkste verschil tussen genomisch DNA en plasmide-DNA-isolatie de methoden van cellyse en zuivering van DNA.

Referenties:

1. Kennedy, Suzanne. "Plasmide versus genomische DNA-extractie: het verschil." Bitesize Bio, 20 juni 2019, hier beschikbaar.

Afbeelding met dank aan:

1. "Figuur 17 01 02" door CNX OpenStax (CC BY 4.0) via Commons Wikimedia 2. "Preparation-of-plasmid-dna-by-mwaqas-noman-hafeez-khosa-6-638" door Noman-Hafeez khosa (CC BY-SA 4.0) via Commons Wikimedia