De grootste verschil tussen DNA- en RNA-extractie is dat de pH-waarde van DNA-extractie is pH 8, terwijl het pH-niveau van RNA-extractie pH 4,7 is. DNA heeft de neiging te denatureren en bij een zure pH naar de organische fase te gaan. Bij alkalische pH ondergaat het RNA alkalische hydrolyse vanwege de aanwezigheid van 2'OH in de ribosesuiker.

DNA- en RNA-extractie zijn de twee procedures die betrokken zijn bij de isolatie en zuivering van nucleïnezuren uit de cellen van weefsels. Beide procedures bestaan ​​uit drie stappen. DNA en RNA van goede kwaliteit spelen een cruciale rol in moleculaire biologie, biotechnologie, genomica en epidemiologische experimenten.

Belangrijkste gebieden die worden gedekt

1. Wat is DNA-extractie? - Definitie, procedure 2. Wat is RNA-extractie? - Definitie, procedure 3. Wat zijn de overeenkomsten tussen DNA- en RNA-extractie? – Overzicht van gemeenschappelijke functies 4. Wat is het verschil tussen DNA- en RNA-extractie? – Vergelijking van de belangrijkste verschillen

Sleutelbegrippen: cellysis, denaturatie van eiwitten, DNA-extractie, pH, precipitatie, RNA-extractie

Wat is DNA-extractie?

DNA-extractie is de isolatie- en zuiveringsprocedure van DNA. DNA kan worden geïsoleerd uit bloed, ingevroren weefselmonsters of paraffineweefselblokken. De drie stappen van DNA-extractie zijn cellysis, isolatie van DNA en precipitatie. Tijdens cellysis breken celmembraanbarrières zoals celmembraan en de membranen van de kern open om DNA bloot te leggen. De volgende stap is het verwijderen van membraanlipiden uit het monster. Ten slotte omvat de precipitatie van DNA de verwijdering van DNA-geassocieerde eiwitten door protease en de verwijdering van RNA door RNase.

Figuur 1: DNA-extractieprocedure

Basisprotocollen van DNA-extractie

Hieronder worden de basisprotocollen van DNA-extractie weergegeven.

1. Cell lysis met de cell lysis buffer om celmembranen te lyseren

2. Lipiden worden afgebroken met detergenten en oppervlakteactieve stoffen

3. Vertering van eiwitten door toevoeging van protease

4. Vertering van RNA door toevoeging van RNase

5. Scheiding van celresten, verteerde eiwitten, lipiden en RNA door toevoeging van geconcentreerd zout gevolgd door centrifugeren

6. Ethanolprecipitatie van DNA met ijskoude ethanol of isopropanol. De ionsterkte van natriumacetaat kan worden gebruikt om de precipitatie te verbeteren. Het geprecipiteerde DNA verschijnt als draden in de uiteindelijke oplossing.

Figuur 2: Geëxtraheerd DNA

Fenol-chloroformextractie kan ook worden gebruikt om DNA van eiwitten te scheiden. Hier denatureert fenol de eiwitten in het monster en blijft het DNA aan het einde van de extractie in de waterige fase. En in de organische fase vind je de gedenatureerde eiwitten. Een andere methode om DNA te extraheren is de minikolomzuivering. Hier is de binding van DNA in de kolom afhankelijk van de pH en de zoutconcentratie van de buffer.

Wat is RNA-extractie?

RNA-extractie verwijst naar het proces van het zuiveren van RNA uit monsters. De conventionele methode van RNA-extractie heet de guanidiniumthiocyanaat-fenol-chloroform extractie. Guanidiniumthiocyanaat denatureert eiwitten. Bovendien verstoort het de waterstofbinding van watermoleculen en dient het als het chaotrope middel. Bij de RNA-extractie wordt een speciaal reagens gebruikt, de Tri-reagens. Het bevat guanidiniumthiocyanaat, fenol en natriumacetaat. Het doel van de basisstappen van RNA-extractie is vergelijkbaar met dat van DNA-extractie. Het protocol voor RNA-extractie wordt hieronder beschreven.

1. Cellen worden gewassen met ijskoude PBS om de osmolariteit van cellen te behouden.

2. Zuig de cellen op en homogeniseer het monster met Tri-reagens.

3. Voeg chloroform toe en schud.

4. Centrifugeren kan resulteren in drie lagen. De bovenste laag is de waterige laag, die helder is. De middelste laag of de interfase bevat het geprecipiteerde DNA. De onderste laag is de organische laag, die roze is.

5. Verwijder de waterige laag en voeg isopropanol toe. Centrifugeren kan resulteren in een pellet.

6. Was de pellet met 75% ethanol. Droog de pellet aan de lucht.

7. Los de pellet op met TE-buffer of water.

Figuur 3: Fenol-Chloroform-extractie van RNA

RNA-extractie wordt over het algemeen uitgevoerd bij een pH lager dan 7. Bij alkalische pH is RNA meer vatbaar voor afbraak door alkalische hydrolyse vanwege de aanwezigheid van een OH-groep op de 2'-positie van de ribosesuiker. Bovendien heeft RNA de neiging om bij zure pH in de waterige fase te blijven. Aan de andere kant heeft DNA de neiging te denatureren en bij een zure pH naar de organische fase te gaan. Daarom kan DNA-extractie worden uitgevoerd bij ongeveer pH 8. DNA bestaat uit deoxyribosesuiker en ondergaat geen alkalische hydrolyse.

Overeenkomsten tussen DNA- en RNA-extractie

Verschil tussen DNA- en RNA-extractie

Definitie

DNA-extractie: Isolatie- en zuiveringsprocedure van DNA

RNA-extractie: Proces voor het zuiveren van RNA uit monsters

Type geëxtraheerd nucleïnezuur

DNA-extractie: DNA

RNA-extractie: RNA

pH

DNA-extractie: Gedaan om 8

RNA-extractie: Gedaan bij 4.7

Stappen

DNA-extractie: Het breken van de celmembranen of cellysis, het verwijderen van de membraanlipiden en het neerslaan van het DNA

RNA-extractie: Cellysis, guanidiniumthiocyanaat-fenol-chloroform extractie, bereiding met isopropanol

Gebruik van met DEPC behandeld water

DNA-extractie: Geen

RNA-extractie: Alle reagentia zijn bereid met DEPC-behandeld water

Opslag

DNA-extractie: DNA kan vooraf worden geëxtraheerd en wordt in batches opgeslagen

RNA-extractie: RNA-extractie gebeurt net voor de downstream-procedures

Lange termijn opslag

DNA-extractie: Bij -20 °C

RNA-extractie: Bij -80 °C

Conclusie

DNA-extractie wordt uitgevoerd bij pH 8. DNA heeft de neiging om naar de organische fase te gaan omdat het denatureert bij zure pH. Maar RNA-extractie wordt uitgevoerd bij een lage pH om afbraak door alkalische hydrolyse te voorkomen. Het basisdoel van de stappen van zowel DNA- als RNA-extractie is vergelijkbaar. Het belangrijkste verschil tussen DNA- en RNA-extractie zijn de pH-omstandigheden die bij elk type extractie worden gebruikt.

Verwijzing:

1. "De basisprincipes van DNA-extractie." Alaska BioPREP Virtual Textbook, Alaska BioPREP University of Alaska Fairbanks, hier beschikbaar2. "RNA-isolatie en reverse transcriptieprotocol: cellen in cultuur." abcam, hier beschikbaar

Afbeelding met dank aan:

1. "Figuur 17 01 02" door CNX OpenStax - (CC BY 4.0) via Commons Wikimedia 2. "DNA-extractie" door Joo Nath - Eigen werk (CC BY-SA 4.0) via Commons Wikimedia 3. "PhOH-CHCl3-extractie" Door Squidonius (talk) - Eigen werk (Oorspronkelijke tekst: zelfgemaakt) (Public Domain) via Commons Wikimedia