Belangrijkste verschil - PCR versus QPCR

PCR (polymerasekettingreactie) en qPCR (kwantitatieve PCR) zijn twee technieken die in de biotechnologie worden gebruikt om DNA voor verschillende doeleinden te amplificeren. PCR is een relatief eenvoudige techniek. qPCR is ook bekend als: realtime PCR of digitale PCR. De grootste verschil tussen PCR en qPCR is dat: PCR is een kwalitatieve techniek, terwijl qPCR een kwantitatieve techniek is. Met PCR kan het resultaat worden gelezen als "aanwezigheid of afwezigheid". Maar in qPCR wordt de hoeveelheid DNA die in elke cyclus wordt geamplificeerd, gekwantificeerd. Als RNA wordt gebruikt in PCR, staat de techniek bekend als RT-PCR (reverse transcription PCR), en als RNA wordt gebruikt in qPCR, staat de techniek bekend als qRT-PC.

Belangrijkste gebieden die worden gedekt

1. Wat is PCR - Definitie, processen, gebruik 2. Wat is QPCR - Definitie, processen, gebruik 3. Wat zijn de overeenkomsten tussen PCR en QPCR – Overzicht van gemeenschappelijke functies 4. Wat is het verschil tussen PCR en QPCR – Vergelijking van de belangrijkste verschillen

Sleutelbegrippen: agarosegelelektroforese, amplicons, DNA-polymerase, fluorescerende kleurstof, PCR, sondes, qPCR, RT-qPCR

Wat is PCR

PCR verwijst naar een techniek in de biotechnologie die de analyse van een korte DNA-sequentie mogelijk maakt door een geselecteerd DNA-segment te amplificeren. Het is een relatief gevoelige methode omdat er voor een enkele reactie zeer kleine volumes nodig zijn. De techniek is gebaseerd op het vermogen van DNA-polymerase om op complementaire wijze nieuwe DNA-strengen te synthetiseren met de aangeboden template-streng. Het reactiemengsel van PCR is samengesteld uit DNA-polymerase, DNA-nucleotiden, primers, de te amplificeren DNA-matrijs en magnesium. De versterking wordt uitgevoerd in een thermocycler. DNA-polymerase moet hittebestendig zijn, aangezien bij deze reactie hoge temperaturen worden gebruikt. De twee soorten DNA-polymerasen die bij PCR worden gebruikt, zijn Taq-DNA-polymerase en Pfu-DNA-polymerase. Taq-DNA-polymerase wordt veel gebruikt in PCR.

DNA-polymerase vereist een reeds bestaande DNA-streng aan het 3'-uiteinde om een ​​nieuwe streng te synthetiseren. Daarom wordt een oligonucleotide-primer toegevoegd aan het reactiemengsel voor de initiatie van DNA-synthese. De vereiste van een primer in PCR maakt de amplificatie van slechts een specifiek gebied in de matrijs mogelijk. De doelsequentie wordt geflankeerd door voorwaartse en achterwaartse primers. Aan het einde van een PCR worden nieuwe kopieën van een specifieke DNA-sequentie genoemd, versterkers, worden verzameld in miljarden. De componenten van de PCR moeten op een zodanige manier worden geoptimaliseerd dat de PCR-prestaties worden verbeterd en storingen worden geminimaliseerd. De standaard PCR-reactie wordt getoond in figuur 1.

Figuur 1: PCR

Stappen van PCR

De drie stappen van een PCR worden hieronder beschreven.

1. Denaturatie – De dubbelstrengs DNA-template wordt door verhitting tot 94-95 °C in twee enkele strengen gescheiden.
2. gloeien – Voorwaartse en achterwaartse primers binden aan de complementaire sequenties in de sjabloon. De temperatuur is afhankelijk van de smelttemperatuur van de primercombinatie.
3. Primer extensie - DNA-polymerase-enzym verlengt elke primer aan hun 3'-uiteinde door complementaire basen aan de groeiende streng toe te voegen. De optimale temperatuur van Taq-polymerase, d.w.z. 72 °C, wordt gebruikt als de temperatuur in de verlengingsstap. De duur van de verlenging hangt af van het aantal basenparen in de matrijsstreng.

De drie stappen worden 28-35 keer herhaald. Agarosegelelektroforese wordt gebruikt bij de fractionering op grootte van PCR-producten. Het product wordt gekleurd door ethidiumbromide en wordt bekeken onder UV. Het PCR-product of het geamplificeerde DNA kan worden gebruikt bij klonering, sequentiebepaling of genotypering.

Wat is QPCR

QPCR verwijst naar een techniek in de biotechnologie die de detectie, karakterisering en kwantificering van nucleïnezuren voor verschillende toepassingen mogelijk maakt. Daarom is het een soort kwantitatieve PCR. Zowel DNA als RNA kunnen als qPCR worden gebruikt. Als RNA als sjabloon wordt gebruikt, moet het eerst omgekeerd worden getranscribeerd in cDNA. Dit type qPCR staat dus bekend als: RT-qPCR. De traditionele PCR wordt uitgevoerd voor cDNA of een gebruikelijk DNA-monster. In qPCR worden echter fluorescerende kleurstoffen gebruikt om het PCR-product in elke stap van de PCR-cyclus te labelen. Dit maakt het verzamelen van gegevens mogelijk naarmate de PCR vordert, waardoor de amplicons tijdens de exponentiële fase van de PCR kunnen worden gekwantificeerd. Het belangrijkste type kleurstof dat in qPCR wordt gebruikt, is SYBR Green. De kleurstof bindt aan het dubbelstrengs DNA. Omdat de fluorescentie proportioneel toeneemt met de hoeveelheid geamplificeerd DNA, kan de kwantificering in "realtime" worden gedaan. Het belangrijkste nadeel van het gebruik van de kleurstof is dat het de kwantificering van één specifiek product in het monster mogelijk maakt. Naast kleurstoffen kunnen ook sondes worden gebruikt in het kwantificatieproces. TaqMan-probes zijn een van de belangrijkste typen oligonucleotide-probes die worden gebruikt in qPCR, en het proces van fluorescentie-emissie wordt weergegeven in figuur 2.

Afbeelding 2: TaqMan-sonde

Probes kunnen zo worden ontworpen dat ze meerdere PCR-producten binnen hetzelfde monster detecteren. TaqMan-sonde is een van de belangrijkste soorten hydrolysesondes; de opname van deze sonde in het PCR-product stelt de fluorofoor bloot en zendt de fluorescentie uit. Fluorescerende kleurstoffen zijn specifieker voor het PCR-product. Daarom worden ze in de meeste diagnostische testen gebruikt om het PCR-product te detecteren.

Overeenkomsten tussen PCR en QPCR

Verschil tussen PCR en QPCR

Definitie

PCR: PCR is een techniek in de biotechnologie die de analyse van een korte DNA-sequentie mogelijk maakt door een geselecteerd DNA-segment te amplificeren.

QPCR: QPCR is een techniek in de biotechnologie die de detectie, karakterisering en kwantificering van nucleïnezuren voor verschillende toepassingen mogelijk maakt.

Kwantitatief kwalitatief

PCR: PCR is een kwalitatieve techniek.

QPCR: QPCR is een kwantitatieve techniek.

Detectie van het product

PCR: Het product wordt gedetecteerd door de agarosegelelektroforese in PCR.

QPCR: Het product kan in elke amplificatiecyclus in qPCR worden gedetecteerd.

Verzameling van gegevens

PCR: De gegevens worden verzameld aan het einde van de reactie in PCR.

QPCR: De gegevens worden verzameld tijdens de exponentiële fase van de reactie in qPCR.

Oplossing

PCR: PCR heeft een zeer slechte resolutie.

QPCR: QPCR heeft een zeer hoge resolutie.

kleurstoffen

PCR: PCR gebruikt ethidiumbromide om het product tijdens PCR te kleuren.

QPCR: QPCR gebruikt fluorescerende kleurstoffen om het product te detecteren.

Tijd

PCR: PCR is een meer tijdrovende methode.

QPCR: QPCR is minder tijdrovend.

RNA

PCR: RT-PCR is het type PCR dat RNA als sjabloon gebruikt.

QPCR: RT-qPCR is het type qPCR dat RNA als sjabloon gebruikt.

Rol

PCR: PCR wordt gebruikt om de aan- of afwezigheid van bepaalde genoomfragmenten te detecteren.

QPCR: QPCR wordt gebruikt om een ​​bepaald fragment in een monster te kwantificeren.

Conclusie

PCR en qPCR zijn twee soorten technieken die in de biotechnologie worden gebruikt om DNA voor verschillende doeleinden te amplificeren. PCR is de traditionele amplificatiemethode die wordt gebruikt om de aan- of afwezigheid van een DNA-fragment te identificeren. QPCR wordt gebruikt om een ​​bepaald fragment in een monster te kwantificeren. PCR is dus een kwalitatieve techniek, terwijl qPCR een kwantitatieve techniek is. Dit is het belangrijkste verschil tussen PCR en qPCR.

Verwijzing:

1. "QPCR versus digitale PCR versus traditionele PCR." Thermo Fisher Scientific, hier beschikbaar.

Afbeelding met dank aan:

1. "PCR" door Madprime - Eigen werk (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia2. "Taqman" door gebruiker: Braindamaged - Eigen werk van de originele uploader (Public Domain) via Commons Wikimedia